發光細菌在毒性試驗的應用

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發光細菌在毒性試驗的應用 (Application of Luminescent Bacteria in Toxicity Test)
國立臺灣大學環境工程學研究所 張淳淳

自然界中有一群會發出生物螢光 (Bioluminescence) 的細菌,統稱為發光細菌 (Luminescent bacteria),除了少數像與線蟲共生的陸生發光異短桿菌 (Xenorhabdus luminescens)、淡水的霍亂弧菌 (Vibrio cholerae) 外,它們大多數生活於海洋中,可於海洋生物的體表、或共生於海洋生物的消化道或發光器官中發現,常見的幾種海洋發光細菌有費氏弧菌 (Vibrio fischeri)、明亮發光桿菌 (Photobacterium phosphoreum)、哈維氏弧菌 (Vibrio harveyi) 等。

雖然發光細菌種類甚多,但生理特性都非常相似、也用相同的原理發光。在它們生長代謝的過程中,會利用本身之螢光素酶 (Luciferase) 和氧分子催化還原態黃素單核酸 (FMNH2) 和長鍊脂肪醛 (RCHO),分別氧化為氧化態黃素單核酸 (FMN) 和長鍊脂肪酸 (RCOOH) 進行產能反應,而釋放出的能量會以最大發光強度在波長 450 – 490 nm 的藍綠螢光形式表現,即上述的生物螢光。發光的反應過程相當複雜,簡化過程如下式與圖一,其中灰底三式之中間產物存續時間極短,很難加以分離出來。

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圖一、一般發光細菌 (Luminescent bacteria) 的生化反應簡圖(本文作者張淳淳繪)

發光細菌在正常的生理條件之下發光強度是穩定且持續的,但一旦受周遭環境影響、比如暴露在污染物之下時,它們的發光程度可能由於螢光素酶活性降低或是其他與發光反應的相關的代謝反應受到抑制,造成發光量減少,而此通常會在一定範圍內呈高度相關,因此我們可藉由對發光強度的量測推估環境中污染物對細菌的毒性。

在諸多以發光細菌作為受試對象的毒性檢測方法中,由美國 Modern Water 公司持有專利的 Microtox® 快速毒性檢測 (Microtox® rapid toxicity detection) 是其中最為所知且廣泛利用者,其他還有 HACH 公司的 LUMISTOX 發光細菌檢測 (LUMISTOX Luminescent bacteria test) 與 ToxAlert 公司開發出的諸多氣體檢測方法等。

以 Microtox® 快速毒性檢測為例,其為一套以費氏弧菌當作試驗生物的毒性檢測系統,試驗架構是先把待測樣品注入菌液一起培養,接著視樣本性質進行過濾後,將液態之樣品與細菌混合液加入比色管 (Cuvette) 並放上螢光儀分析。其螢光量的改變通常用 $$\Gamma~\text{(Gamma)}$$ 值來表示,計算式如下。

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舉例來說,整個實驗進行時間共為 $$30$$ 分鐘,$$\Gamma$$ 的計算就是以 $$0$$ 分鐘的初始螢光量減去 $$30$$ 分鐘之螢光量、再除以結束時間點螢光量所求得之比值,可以呈現出目標污染物或是該系統環境毒性的程度,其 $$\Gamma$$ 螢光量減少的程度較為劇烈,因此濃度或毒性可能越強;而若 $$\Gamma$$ 越小則反之。

除了用 $$\Gamma$$ 表示外,也可以換算成半最大效應濃度 $$\mathrm{EC_{50}}$$ (Half maximal effective concentration) 來表示,如下圖二所示,在找出濃度與 $$\Gamma$$ 的線性關係後(橘框處公式),可以用 $$\Gamma=1$$ 帶入方程式求出對應的濃度、即為 $$\mathrm{EC_{50}}$$。$$\mathrm{EC_{50}}$$ 在毒理學 (Toxicology) 上是一常用的單位,可以使得 Microtox® 檢測法的數據更有比較性及代表性。

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圖二、Microtox® 快速毒性檢測中的 $$\Gamma$$ 值與濃度之關係示意圖(本文作者張淳淳繪)

比起使用其他試驗生物的毒性檢測,使用發光細菌的諸方法都有試驗材料易於購置、反應時間短、操作簡單與成本經濟等特性,因此包括國際標準化組織 ISO (International Organization for Standardization)、德國標準化學會 DIN (Deutsches Institut für Normung e.V.)、美國材料與試驗協會 ASTM (American Society for Testing and Materials) 等皆將發光細菌毒性檢測列入標準檢測方法,廣泛應用於水質、空氣、土壤及底泥等環境中的污染監測中。


參考文獻

  1. Niemeyer, C. M., Koehler, J., & Wuerdemann, C. (2002). DNA‐directed assembly of bienzymic complexes from in vivo biotinylated NAD (P) H: FMN oxidoreductase and luciferase. ChemBioChem3(2‐3), 242-245.
  2. Hao, O. J., Lin, C. F., Jeng, F. T., & Shih, C. J. (1995). A review of microtox test and its applications. Toxicological & Environmental Chemistry52(1-4), 57-76.

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