蛋白質立體結構（protein structure）的解析–上

蛋白質立體結構（protein structure）的解析–上
台北市立成功高級中學生物科洪敬承老師/國立台灣師範大學生命科學系李冠群助理教授責任編輯

蛋白質結構：依序為一級到四級結構

分析蛋白質立體結構的程序大致如下，先以基因轉殖的大腸桿菌大量生產標的蛋白質，其方法為利用分子選殖技術將研究標的基因DNA，置入大腸桿菌的表現載體，之後利用轉型技術將表現載體轉入大腸桿菌中，表現的蛋白質其胺基酸序列可由DNA可以推導出，接下來進行一系列蛋白質的純化步驟，取得高純度的蛋白質後，運用化學試劑將水溶性的蛋白質，轉換成蛋白質晶體，在X光繞射法下，將所得數據經由一系列的數學運算，轉換得其三維立體結構。

為了得到菌體內未變性（即未喪失三級結構和活性）的蛋白質，將基因轉殖菌體加入機器中的容器內，再以高壓破菌器Fresh Press將容器內的基因轉殖菌體，快速通過容器的小孔出口（其口徑小於大腸桿菌），如此即可將具有細胞壁的大腸桿菌，壓破釋放出菌體內的各種蛋白。

利用快速液相色譜儀（FPLC）搭配不同性質和特性的純化蛋白質用的管柱，依照研究標的蛋白質的特性，可以從已破菌的菌液中分離出標的蛋白質。純化蛋白質用的管柱，可以分為：(1)親和性管柱：經典代表為鎳金屬的樹脂，當將研究標的在其蛋白質的頭或尾端，加上6個His（可與鑷金屬結合形成敖合物），之後在利用與His類似的化合物，與和鎳金屬結合的蛋白質競爭，進而分離出帶6個His的研究標的蛋白質；(2)分子篩管柱: 可以依照分子量大小不同，導致流出管柱的時間點不同來分離；(3)離子交換樹脂管柱：利用蛋白質在不同pH值下，會使蛋白質改變其本身的電荷，來達到吸附管柱的效果，將研究標的蛋白質與其他大腸桿菌本身所攜帶的蛋白質分離。

利用UV光OD280（波長280nm）可偵測蛋白質的特性，可以將從管柱流出的蛋白質繪出吸收峰圖型，在對照收集圓盤內所純化蛋白質的收集試管，搭配蛋白質電泳SDS-PAGE觀測，取試管內的液體進行蛋白質電泳，可以更加確定蛋白質的分子量及純度。

在確認試管內蛋白質為研究標的蛋白質後，接下來就是近一步確定研究標的蛋白質的純度是否達到水準，基本上須達到95%以上的純度，之後接著進行蛋白質濃縮的工作，因為需要將蛋白質濃縮到快接近過飽和的狀況，才有機會長出晶體，在蛋白質結晶方面，藉由配製出適合該種蛋白質的介質，使該蛋白質達到飽合濃度，進而析出長出晶體，這時需借助生技公司開法的片盤.，每個片盤上有96個孔洞，孔洞內則有不同條件的介質以利蛋白質的析出與長晶。通常需試上1000種以上的條件才可找出最接近一種蛋白質析出或長晶的介質，此過程稱為結晶條件之隨機篩檢（random scan）。接著以此種介質為條件，人工配置微調介質成份的自製介質，再將此一蛋白質放入新片盤，藉以得到一種蛋白質析出或沉澱的最佳濃度或成份比例，可將蛋白質置於光學顯微鏡下觀察其結晶形狀，確認最佳蛋白質析出或沉澱之介質。

參考文獻：
維基百科-蛋白質結構：http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_structure