植物抗凍蛋白在基因改造生物的應用（Antifreeze Proteins ,AFPs）

植物抗凍蛋白在基因改造生物的應用（Antifreeze Proteins ,AFPs）
國立台中第二高級中學生物科龔雍任實習老師/國立台灣師範大學生命科學系張永達副教授責任編輯

植物的生產力受到各種環境壓力(stress)的影響，例如凍害(freezing)、乾旱(drought)、淹水(flooding)等，而要忍受這些環境壓力，有效的方法便是將保護性的蛋白或酵素利用基因轉殖的方式轉入植物的細胞中，利用基因工程的方法增強植物的耐受性(tolerance)。

欲將抵抗環境壓力的蛋白轉殖入原本無法忍受的植物體內，共可分為六個步驟：(1)找尋生存於極端壓力環境下的生物，(2)了解此生物抵抗環境壓力的機制，(3)將特定的基因選殖(clone)出來，(4)利用原生生物的模式(prokaryotic model)確定其基因所轉錄出的蛋白質產物，(5)將基因插入植物的系統並給予其壓力，測試其作用能力，(6)將基因轉殖入非耐受性植物中，作田野測試。而依賴此套基本模式，目前已經在其他生物中找到數種抗凍基因(antifreezing gene)，例如目前已發現可由E. coli中選殖出BetA，殖入馬鈴薯內，以及由比目魚(winter flounder)內選殖出AFP，轉殖入煙草中，都有抗凍的效果。以下針對抗低溫壓力相關的基因轉殖種類討論

1.抗冷基因(antichilling gene)
對於原本生長在溫暖環境的植物而言，抗冷(antichilling)的作用相當重要，因為當溫度下降時會阻礙膜的流動性(flexibility)；而在增加雙層膜的流動性方面，因為生物膜上的非飽和性脂肪酸與植物的耐冷性有關，若是脂肪酸上具有cis-雙鍵，可以降低脂質由液態轉變成固態的中間態溫度(transition temperature)，約降低到0℃。因此耐冷性植物細胞膜在低溫時脂質也不會凝固，細胞可維持正常活性。目前也有許多抗冷基因被發現且殖入植物，例如Des9，一個廣專一性的△9-去飽和基因，由一種藍綠藻中選殖出，且已經成功轉殖入煙草植株中，可造成煙草的不飽和脂肪酸提高17倍，而將此基因轉殖植株放入1℃的環境，也不會產生葉片萎黃(chlorosis)的現象。

2.抗凍基因(antifreezing gene)
抗凍蛋白(AFPs)可以調控冰的生長，會在一個特定的溫度內維持冰晶的穩定，而會抑制冰的再結晶，AFPs可在許多生物體內發現，例如細菌、真菌、植物、無脊椎動物與魚類，而且在這些生物體內還可形成多種抗凍蛋白。ATPs會限制冰晶生長，且會抑制水分子外接上微小冰晶，此過程稱為抑制吸附作用(adsorption-inhibition)；冰的再結晶(recrystallization)會使小的冰晶增大，而大的冰晶會造成細胞組織的物理性破壞，而因為ATPs會吸附在冰晶的面上，影響其之後冰晶的形成，而此過程會使得自由能的升高，不趨向形成冰晶的過程，因此會降低凝固點，達到抗凍的功能，而形成超冷現象(supercooling)。
根據實驗發現，AFPs在可耐寒植物體內扮演的角色並非阻止細胞外冰的生成，而是限制冰晶的繼續增大，因此AFPs的重要任務是減低冰晶造成的物理性傷害。若AFPs出現在細胞膜表面，便可阻止細胞原生質體的冰凍，尤其是對低溫敏感(sensitive)的、含有許多水分的組織。另外，AFPs還可使細胞膜外的冰晶維持小型的狀態，因為AFPs會抑制冰晶的再結晶現象。

抗凍蛋白或抗凍糖蛋白溶液的冰晶生長溫度低於其熔點溫度，這種冰晶的熔點與冰晶生長點之差稱之為熱滯(thermal hysteresis)。這種效應是一種非依數性(non-colligative)效應。若考慮抗凍蛋白與冰晶表面的相互作用特點，用吸附反應動力學的角度討論了抗凍蛋白的抗凍活性討論結果如下。

(1)抗凍蛋白分子和溶劑分子分別與冰晶表面的相互作用是一種可逆吸附過程，並且一個抗凍蛋白分子在吸附過程中占據n個吸附中心。
(2)抗凍蛋白溶液的熱滯效應是一種合作效應，n個抗凍蛋白分子同時與冰晶表面的相互作用是一種可逆吸附過程。
(3)因為抗凍蛋白的抗凍活性是由於熱滯蛋白吸附到冰晶表面，從而阻止冰晶的生長。所以，我們可以定義抗凍蛋白在冰晶表面的覆蓋度為：xt=ΔT/ΔTm。其中ΔT是由於抗凍蛋白分子引起的熔點與冰晶生長點之差，即抗凍活性，ΔTm是最大的抗凍活性。
(4)抗凍蛋白分子的抗凍活性與抗凍蛋白溶液濃度的定量關係的理論計算結果與實驗結果符合。
(5)對於分子量較大的抗凍蛋白，例如Type II AFPs，其一個分子在冰晶表面的吸附中心數與蛋白的合作數幾乎相等；對於分子量較小的抗凍蛋白，例如Type I AFPs，其蛋白的合作數要大於一個蛋白分子在冰晶表面的吸附中心數，說明大分子量的抗凍蛋白具有較多的吸附中心。對於分子量較小的抗凍蛋白分子溶液，即使濃度相同，溫度較低時的抗凍活性要低於溫度較高的抗凍活性，要求的抗凍蛋白合作數也增加。因此，當濃度較低時它們將失活去活性。隨著濃度的增加，各種抗凍蛋白的活性都將達到飽和。分子量較大的抗凍蛋白的吸附常數Kt遠大於分子量較小的抗凍蛋白的吸附常數，說明大分子量的抗凍蛋白具有較強的與冰晶表面結合的能力。

部分植物、昆蟲、魚類因為生活於極寒冷的環境，故會產生抗凍蛋白(antifreeze proteins；AFPs)或抗凍糖蛋白(antifreeze glycoproteins；AFGPs)以保護組織。抗凍蛋白可以分為三類，Type I AFPs主要含有alanine，由α-螺旋組成的蛋白；Type II AFPs 主要是由cysteine所組成的球狀蛋白；Type III AFPs 是小型的球狀蛋白。此三類蛋白皆可藉由氫鍵鍵結於冰晶的特定平面上形成冰-蛋白質複合物，影響冰晶堆積的角度而影響冰晶再結晶的過程。以第一型抗凍蛋白(AFPs)為例：此抗凍蛋白發現於極地的魚體內，含有11個胺基酸的單位形成α-helical次級構造，AFPs具有獨特的功能，可以中和冰的晶核(nucleators)，並且抑制其再結晶。目前，此套機制已在煙草中實行，可以抑制水的再結晶。另有實驗將Type I AFP從比目魚的體內取出，加到bromegrass的細胞懸浮培養液中，便可以明顯減緩其冰凍的速率，且其產生的冰晶數量也比控制組少很多。

未來展望
植物比動物更早登陸，演化的時間也遠比動物為長，因此在植物體內抵抗環境壓力的機制其實相當健全，除了以上所整理的資料以外，世界上的植物生理學家仍然在植物環境逆境的領域中研究，而資料中也時常出現「詳細調控機制不明」，因此應該還有很大的研究空間。而之後的主題提及基因轉殖的技術，其實也與現在很熱門的G.M.O.有關，現在很多馬鈴薯的品種中都已經添加魚的抗凍基因；而這是解決某些地區糧食問題的一個方法，尤其是馬鈴薯這類的主食經過基因改良，便可以多一個耕種期，在低溫時也可生長，若是經濟狀況較差的國家，其起碼的食物來源便不虞匱乏了。若將抗凍基因轉殖到食用牲畜中中，當其肉品放入冰箱冷藏時便不會產生冰晶，影響口感。可見基因轉殖的技術對於人類生活的改善是很有助益，值得繼續研究。