螢光原位雜合技術

螢光原位雜合技術 (Fluorescence in situ hybridization, FISH)
國立臺灣師範大學生命科學系研究助理林如愔

螢光原位雜合技術（FISH）是一種細胞遺傳學技術，可以用來檢測基因體上面特定核苷酸序列的存在，亦可藉由檢測信使RNA（mRNA）的表現量來觀測基因的表現。其基本原理如圖一所示：在小片段的DNA探針上以缺口轉化法（nick translation）標定Dig-dUTP或Biotin-dUTP，接著取一片經由福馬林（formalin）固定好的組織切片，將帶有標定的單股DNA探針與之進行雜合，完成之後使用螢光標定的Anti-Dig/Biotin抗體（antibodies linked with a fluorophor）進行檢測。此抗體會專一性結合上樣本中已經被Dig/Biotin標記引子雜合的核酸，螢光標定的抗體可在螢光顯微鏡下被觀測到螢光。

圖一 FISH機制示意圖

相比於傳統用於檢測DNA/RNA存在或表現量的PCR，RT-PCR或real-time PCR等技術，FISH存在以下特色：

1.其檢測方式為直接將探針送入固定好的細胞/組織中進行檢測，比起將核酸取出的PCR檢測方式，FISH除了偵測表現量的變化之外，更能夠對目標核酸序列在細胞內或是組織內的分佈有視覺性的直接觀察。

2.PCR產物需要用膠體電泳的方式觀察。引子對間可能的相互干擾或是相似的產物大小會嚴重影響結果的觀察，而使得很難藉由在同一個反應中放入不同的引子對來同時檢測不同的產物。然而FISH可以利用不同的螢光蛋白，簡單的以顏色來分辨不同的目標序列。

3.對比一般PCR需要一定數量的細胞來萃取DNA/RNA進行反應，FISH可以在單個細胞的數量級進行獨立的檢測，如圖三。這在諸如病毒感染、細胞病變或突變等領域的檢測及治療的評估扮演了重要的角色。

在此以乳癌HER2基因的檢測說明FISH技術在臨床應用上的價值，HER2的全文為「第二型人類表皮生長因子接受體」，是一個在正常細胞中也會表現的基因。但是在癌症細胞中此基因會被過度表現使得細胞表面有過多的生長因子接受體可以接受生長因子的刺激，致使細胞生長與分裂快速，表現出癌細胞的行為。乳癌病患中大約有25~30%為HER2陽性反應，由於其生長快速的特性使得治療的策略需要特別謹慎的選擇。因此HER2基因的檢測在乳癌病例中非常的重要，目前的檢測方式為免疫組織化學染色法（immunohistochemistry, IHC）與FISH兩階段的檢測方式。由操作快速、不需要螢光顯微鏡的IHC技術進行初步檢測。呈現弱陽性以上反應之檢體轉由FISH技術進行量化檢測，結果交由醫師與病患討論接續之治療方式。

FISH技術提供了基因表現定量與分佈的檢測方式，並能以視覺化的方式被觀察。結合PCR、IHC、西方墨點法（western blot）以及凝集反應（agglutination reactions）等檢驗技術，可以讓我們對細胞層級的分子生物學與生物醫學研究有更多觀察的手段，並有更全面性的了解。

參考資料

1. 乳癌網站 HER2 CLUB http://her2club.com.tw/Default.aspx
2. Drosophila Image Award – 2005 http://www.drosophila-images.org/2005.shtml
3. Fluorescence in situ hybridization http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_in_situ_hybridization
4. Immunohistochemistry http://en.wikipedia.org/wiki/Immunohistochemistry
5. miRNA in situ hybridization (FISH) assay http://www.panomics.com/products/rna-in-situ-analysis/viewrna-mirna-ish-cell-assay/data-specification